Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của loài sán lá phổi Paragonimus westermani ở Việt Nam

Tuy nhiên, đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của loài sán lá phổi này ở Việt Nam chưa được biết. Do đó nhằm nghiên cứu đặc điểm sinh học và kiểu phát triển của loài sán lá phổi P. westermani và xác định khả năng gây bệnh của loài này ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu do TS. Phạm Ngọc Doanh, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đứng đầu đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của loài sán lá phổi Paragonimus westermani ở Việt Nam” với các nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Xác định vật chủ tự nhiên của P. westermani ở Việt Nam: Nội dung này được thực hiện tại tỉnh Quảng Trị, vì nơi đây có tỷ lệ nhiễm metacercariae của sán lá phổi ở cua suối tương đối cao.

- Xét nghiệm cua núi tìm ấu trùng metacercaria của sán lá phổi và xét nghiệm ốc tìm Cercaria của sán lá phổi: cercaria của sán lá phổi thuộc nhóm microcercariae, nếu thu được nhóm này, định loại cercariae bằng cách đọc trình tự gen ITS2, và xác định tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá phổi ở ốc.

- Xác định loài vật chủ chính: thu mẫu phân động vật hoang, xét nghiệm tìm trứng sán lá phổi. Định loại loài sán lá phổi từ trứng bằng trình tự ITS2. Mẫu phân có trứng sán lá phổi được sử dụng để định loài vật chủ bằng trình tự vùng DLoop.

- Nghiên cứu khả năng sống của metacercaria ở các điều kiện nhiệt độ và môi trường khác nhau.

- Điều tra, xác định khả năng gây bệnh cho người của P. westermani ở Quảng Trị bằng kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng thể chống kháng nguyên P. westermani, nếu phát hiện bệnh nhân dương tính thì xét nghiệm phân, đờm tìm trứng sán, nếu có thì dùng kỹ thuật PCR để nhân bản và đọc trình trình tự ITS2 để xác định loài sán lá phổi. 

Sau 3 năm (07/2013 - 05/2016) triển khai nghiên cứu, nhóm nghiên cứu đã thu được các kết quả nghiên cứu như sau (các kết quả nghiên cứu này cũng đã được công bố trên tạp chí Journal of Helminthology và tạp chí Sinh học):

1. Xác định vật chủ tự nhiên của loài P. westermani:
   • Vật chủ trung gian thứ 2: là các loài cua núi V. aluoiense, Donopotamon haii tại tỉnh Quảng Trị với tỷ lệ nhiễm metacercariae tương đối cao và Indochinamon tannanti ở huyện Lục Yên, Yên Bái với tỷ lệ nhiễm thấp.
   • Vật chủ chính: Kết quả xét nghiệm đã phát hiện trứng sán lá phổi ở 7/120 mẫu phân động vật hoang thu tại huyện Da Krong. Phân tích trình tự gen ITS2 từ trứng sán và so sánh với các trình tự trên Genbank bằng chương trình BLAST đã xác định được 3 loài P. westermani (3 mẫu), P. skrjabini

(2) và P. heterotremus (2). Phân tích trình tự vùng Dloop từ 7 mẫu phân động vật dương tính với trứng sán lá phổi đã xác định được loài vật chủ của các loài sán lá phổi là mèo rừng Prionailurus bengalensis.

• Vật chủ trung gian 1: Kết quả xét nghiệm ốc tại xã Da krong, huyện Đa Krong và xã Hướng Sơn, huyện Hướng Hóa là 2 địa điểm có tỷ lệ và cường độ nhiễm P. westermani ở cua núi cao nhất đã tìm thấy ấu trùng microcercaria ở ốc Tricula sp. tại xã Hướng Sơn với tỷ lệ 0,4% (6/1530).

2. Sức sống của metacercaria ở các điều kiện khác nhau:

Metacercariae của sán lá phổi P. westermani sống trong nước muối sinh lý 0,9% tốt hơn so với nước cất. Ở điều kiện 4⁰C ấu trùng sống được lâu hơn so với điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm hoặc 37⁰C. Ở nhiệt độ 37⁰C metacercaria thoát khỏi nang nhanh sau 2h, sống được 15 ngày ở nhiệt độ phòng 27⁰C, nhưng sống tới 1 năm khi bảo quản ở tủ lạnh 4⁰C.

3. Sự phát triển của sán lá phổi ở động vật thí nghiệm:

Gây nhiễm metacercaria của sán lá phổi P. westermani cho động vật thí nghiệm: chuột bạch, chó nhà và mèo nhà, với số lượng 20 metacercariae/chuột và 30-50 metacercariae/chó, mèo cho thấy: ở tất cả chuột bạch gây nhiễm đều thu được sán non ở cơ và gan, với tỷ lệ phát triển từ 25-75% (trung bình 50,5%), trong đó sán thu được ở cơ chiếm tỷ lệ 65,3% và ở gan là 34,7%. Sán non này chỉ hơi lớn hơn về kích thước so với metacercaria mới thoát khỏi nang. Dùng sán non này gây nhiễm chuyển tiếp cho chó và mèo để xác định vai trò vật chủ chứa. Ở chó, cả 5 cá thể đều không bị nhiễm sán. Ngược lại, tất cả mèo đều bị nhiễm sán. Tỷ lệ phát triển của sán khi gây nhiễm trực tiếp bằng metacercaria là 13,354,3%, tương đương như khi gây nhiễm bằng sán non thu từ chuột (43,348,9%). Các cá thể sán thường sống từng đôi tạo thành ổ apxe ở phổi, một số cá thể sán thu được ở xoang phổi sau gây nhiễm trên 170 ngày. Đa số sán chưa trưởng thành, tỷ lệ sán trưởng thành thấp. Thời gian thải trứng từ 140-145 ngày sau gây nhiễm.

Kết quả nghiên cứu này khẳng định quần thể P. westermani ở Việt Nam không phát triển ở chó thí nghiệm, nhưng phát triển được ở mèo nhà với tỷ lệ phát triển thấp và thời gian trưởng thành tương đối lâu. Những đặc điểm này tương tự với quần thể P. westermani ở Malaysia. Kết quả này gợi ý rằng động vật hoang đóng vai trò là vật chủ quan trọng hơn so với động vật nuôi (chó, mèo). Vì vậy, trong công tác cứu hộ động vật tại Vườn Quốc gia Bắc Hướng Hóa và Da Krong cần chú ý đến bệnh sán lá phổi do nhiễm P. westermani vì tỷ lệ nhiễm metacercaria ở cua núi khu vực này là rất cao.

4. Khả năng gây bệnh ở người:

Xét nghiệm 100 mẫu huyết thanh của những người có triệu chứng nghi ngờ sán lá phổi ở 2 huyện Đa Krong và Hướng Hóa bằng kỹ thuật  ELISA nhưng đều cho kết quả âm tính với sán lá phổi. Về khả năng gây bệnh cho con người ở Việt Nam, mặc dù các tài liệu trước đây công bố duy nhất chỉ có loài P. westermani và được cho là nguyên nhân gây bệnh sán lá phổi ở người, nhưng không có bằng chứng cụ thể như mẫu vật hoặc kết quả định loại bằng sinh học phân tử. Cho đến năm 1995 thì loài P. heterotremus được tìm thấy phổ biến ở các tỉnh miền bắc Việt Nam và được xác định là nguyên nhân gây bệnh ở người. Gần đây, metacercaria của loài P. westermani mới chỉ được phát hiện ở một số tỉnh miền Trung, đặc biệt là ở tỉnh Quảng Trị với tỷ lệ nhiễm ở cua núi rất cao, có thể tới 96%. Tuy nhiên, chưa có thông báo nào về ca bệnh sán lá phổi ở khu vực này. Vì vậy, khả năng gây bệnh cho người của P. westermani ở Việt Nam vẫn chưa được khẳng định chắc chắn.

5. Xác định P. westermani có ở miền Bắc và P. heterotremus có ở miền Trung hay không và đa dạng hình thái và di truyền của chúng:

Kết quả xét nghiệm 200 cá thể cua núi Indochinamon tannanti tại 2 xã thuộc miền Bắc: xã Lương Sơn, Bảo Yên, Lào Cai và An Lạc, Lục Yên, Yên Bái cho thấy tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá phổi ở 2 địa điểm tương đối cao: 82.8% và 4-504 metacercariae/cua tại Lương Sơn, và 70.0% và 1-362 metacercariae/cua ở An Lạc. Kết quả định loại đã xác định cua núi tại xã Lương Sơn, Lào Cai bị nhiễm 2 loài sán lá phổi P. heterotremus và P. vietnamensis.  Tại xã An Lạc, Yên Bái cua núi bị nhiễm ấu trùng 4 loài sán lá phổi: P. heterotremus (69,2%), P. vietnamensis (6,0%), P. westermani (13,8%) và P. bangokensis (1,5%). Đây là lần đầu tiên metacercariae của loài P. westermani tìm thấy ở miền Bắc.

Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử cho thấy metacercaria ở Yên Bái tương đối đồng nhất về hình thái, trong khi metacercariae ở Quảng Trị rất  đa dạng, có thể chia thành 5 loại khác nhau về hình dạng, kích thước và độ dày lớp vỏ trong. Kết quả phân tích phân tử dựa trên trình tự ITS2 và gen ty thể 16S cho thấy tính tương đồng cao về di truyền của các mẫu P. westermani ở Việt Nam bất kể sự khác biệt về địa lý và đa dạng hình thái: sự sai khác về trình tự ITS2 là 0.2-0.4% và gen ty thể 16S là 1,1-1,4%. Ở cả 2 cây phát sinh chủng loại từ trình tự ITS2 và gen ty thể 16S đều cho thấy tất cả các mẫu P. westermani  của Việt Nam làm thành một nhóm gần với các trình tự từ Đông Á (Japan, Korea, China và Taiwan) hơn là so với nhóm Đông Nam Á (Thái Lan, Malaysia và Philippines), gợi ý rằng P. wetsermani của Việt Nam có nguồn gốc từ Đông Á.

Kết quả điều tra cũng thu được metacercaria của P. heterotremus tại xã  Tà Rụt, huyện Da Krong và xã Tân Thành, huyện Hướng Hóa, Quảng Trị với tỷ lệ và cường độ nhiễm rất thấp 0,02% và cường độ nhiễm 1 metacercariae/cua. Kết quả phân tích hình thái và phân tử thu từ miền Bắc (Yên Bái) và miền Trung (Quảng Trị) cũng cho thấy sự đa dạng về kích thước của metacercariae nhưng có sự tương đồng cao (100%) về di truyền. Kết quả phân tích phân tử cũng khẳng định lại vị trí phân loại của loài P. pseudoheterotremus mô tả từ Thái Lan chỉ là một quần thể của loài P. heterotremus, chứ không phải loài độc lập.

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 12676-2016) tại Cục Thông tin Khoa học và Công nghệ quốc gia.